روشهای مختلف آزمایشگاهی در تعیین ژنوتیپ های اسب در دنیای امروز
روشهای مختلف آزمایشگاهی در تعیین ژنوتیپ های اسب در دنیای امروز به نام خدا
از آنجائیکه استفاده از روشهای مختلف آزمایشگاهی در تعیین ژنوتیپ های
اسب در دنیای امروز رایج گردیده است و هموطنان عزیز ما نیز کم و بیش
اطلاعات و شنیده هایی از بابت این روشها دارند لازم دیدم بطور کاملا
خلاصه مطلبی راجع به تفاوت این روشها به اطلاع مالکین و علاقمندان
محترم برسانم.
با تشکر
مسعود خلیلی
مهرماه ۱۳۹۴
تفاوت روش های توالی یابی و تعیین ژنوتیپ ژنوم در اسب:
همانطور که از اصطلاح تعیین ژنوتیپ مشهود است دراین روش، افراد برای یکسری جایگاهای ژنومی مشخص، تعیین ژنوتیپ می شوند. از روش های تعیین «وتیپ می توان به دو روش ژنوتیپ، استفاده از نشانگر(مارکر) های میکروساتلایت(SSR) و تراشه های ژنومی ۵۰هزار و یا ۷۰هزار SNP اشاره کرد. ژنوم اسب به طور متوسط دارای ۲.۵ الی ۲.۷ میلیارد جفت باز می باشد که از این تعداد، برخی از جایگاهها با توجه به تنوع ( پلی مورفیسم بودن SNPها)، عاملی بودن (سببی بود یا causative) و رعایت فاصله بین جایگاه بادرنظر گرفتن میزان LD تعیین ژنوتیپ می بشوند که در روش SSR تنها تعداد معدودی جایگاه حدود ۱۰-۱۰۰ مارکر تعیین ژنوتیپ می شوند. در روش دوم که تعیین ژنوتیپ با تراشه های ژنومی می باشد، تعداد مارکرهای بیشتری به نسبت روش SSR مورد بررسی قرار میگیرد و حدود ۵۰ الی ۷۰ هزار مارکر SNP را دربرمیگیرد که برروی تراشه های ژنومی تجاری طراحی شده اند. لازم به ذکر است که مارکرها انتخاب شده باید مورد تایید تیم تحقیقاتی ژنوم اسب زیر نظر انجمن جهانی ژنتیک حیوانی (ISAG) و همچنین اعضای پروژه جهانی ژنوم اسب (HGP) باشند.
روش مارکرهای میکروساتلایت:
*مزایا
بررسی و تصحیح روابط شجره، نسبتاً کم انجام آزمایش، سرعت بالا، امکان انجام در بسیاری از آزمایشگاههای مرجع ژنتیکی
*معایب
عدم امکان بررسی تنوع ژنتیکی کل ژنوم اسب، امکان خطا در آزمایشگاههای مختلف، درنظر گرفتن تنها ۰۰۰۰۰۲/۰ درصد کل ژنوم یعنی به ازای هر یکصد میلیون باز از ته موجود در ژنوم اسب حدود دو جایگاه بررسی می شود.
روش تراشه های ژنومی (SNP bead chip):
*مزایا:
سرعت نسبتاً بالا
روش اجرا:
الف-نمونه برداری
برای این تحقیق سعی می شود از تعداد حدود ۱۰ راس اسب خالص از کل جمعیت های اسبهای موجود در هر نژاد با استفاده از ونوجکت حاوی ماده ضد انعقادEDTA از سیاهرگ گردنی خونگیری به عمل آید. میزان خون استحصالی از هر اسب در ونوجکت ۴ میلی لیتر خواهد بود. نمونه های خود در محیط سرد بلافاصله پس از استحصال به آزمایشگاه منتقل و در فریزر ۲۰- درجه سانتیگراد تا زمان استخراج DNA نگهداری می شود.
ب- استخراج DNA
کل DNA ژنومیک با استفاده از کیت استخراجی DNA از خون پستانداران استخراج خواهد شد.
ج-توالی یابی ژنوم
نمونه ها از ۱۰ راس اسب دارای شجره و خلوص نژادی مرتبط با ویژگی های مورفولوژیکی نژاد مربوطه جمع آوری شده و پیش از انجام توالی یابی High-throughput، از یک روش شاده و کم هزینه برای غنی سازی ژنومی استفاده خواهد شد. برای توالی یابی از دو روش Illumina GAIIx sequencer وNex Generation Sequencing (NGS) استفاده خواهد شد. پیش از این نیز از همین روش با دستگاه ۴۵۴ استفاده خواهد شده است. کاهش الگو(Template reduction) بمنظور اطمینان از پوشش مناسب ژنومی، خصوصاً برای ژنوم های بزرگ ضروری خواهد بود. در این تحقیق هضم با آنزیم برشی و انتخاب براساس اندازه بر روی ژل آگارز بکار خواهد رفت. با توجه به اینکه در این روش از Ligating bar codes برای DNA هر فرد استفاده خواهد می شود، این پروتکل برای مطالعاتی که در آنها از تعداد زیادی فرد استفاده می شود (مانند نقشه ارتباطی، اکولوژی مولکولی و ژنومیکس جمعیت) مناسب است.
مراحل این روش مشابه پروتکل AFLP است و به آسانی می تواند برای تغییر تعداد نواحی الگوی تولید شده برای توالی یابی اصلاح خواهد گردد. در ابتداDNA الگو با استفاده از دو آنزیم برش داده می شود، سپس تکثیر با PCR صورت خواهد گرفته و گزینش بر اساس اندازه و بمنظور تولید قطعات مختلفت برای توالی یابی، برروی ژل آگارز صورت خواهد گرفت. با بکارگیری تکنولوژی توالی یابی Illumine و بارکدهای ۱۰ بازی منحصر به فرد، امکان مخلوط کردن محصولات برای توالی یابی چندگانه با کارایی بالا فراهم نیز استفاه خواهد شد. علاوه بر این، قرار دادن بارکد درون قطعات توالی یابی شده، نیاز به استفاده از آغازگر دوم Illumina را مرتفع می سازد.
*معایب:
هزینه نسبتاً بالا
عدم وجود SNP های اختصاصی اسب های بومی ایران در تراشه های تجاری، چرا که در زمان تهیه این تراشه نمونه توالی یابی شده از اسب های بومی ایران وجود نداشت.
درنظر گرفتن تنوع کمتر باتوجه به درنظر گرفتن تعداد جایگاه کمتر، به ازای هر یکصد هزار باز موجود در ژنوم اسب حدود دو جایگه بررسی می شود
نیاز به تعیین توالی بازهای ژنومی مورد نیاز اطراف SNP مورد نظر و SNP مرتبط با عملکرد
همانطور که ذکر شد از حدود ۲.۵ میلیارد جفت باز تنها تعداد ۰۰۲/۰ درصد از آنها یعنی ۵۰ تا ۷۰ هزار جایگاه جهت تعیین ژنوتیپ طراحی شده که لازم اسب جهت بررسی دقیق ارتباط با جایگاهها با عملکرد و تعیین خلوص و یا عدم خلوص بالاتر، نیاز به تعیین توالی بازهای ژنومی اطراف هر مارکر SNP می باشد.
نکته: مهمترین دلیل انجام توالی یابی اسب های پایه برای تشکیل پایه ژنومیکی نیاز به توالی یابی مجدد نمونه های خالص تعیین شده برای SNP های خاص نژادی برآورده شده با روش تراشه های ژنومی می باشد.
توالی یابی:
در روش توالی یابی، امکان بررسی تمام تنوع ژنومی موجود در هر فرد را با استفاده از تکنولوژی های نوین فراهم می کند که در حال حاضر با حداقل هزینه ممکن به نسبت دیگر روشهای موجود مانند تعیین ژنوتیپ با روش تراشه های ژنومی، توالی کل ژنوم افراد شناسایی شده و باتوجه به موارد مذکور در این روش با دقت بالا برای موارد زیر نیز بکار گرفته شود.
امکان انجام آنالیز بیوانفورماتیکی، بررسی شبکه های زیستی، بررسی مطالعات اومیکس(ژنومیکس، پروتئومیکس، متابولومیکس)
*الزامات: انجام این روش تنها برای تعداد اسب خالص جهت تشکیل پایه ژنومیکی الزامی می باشد و بعد از تشکیل پایه ژنومیکی اسب های دیگر جهت مقایسه با پایه از روشهای دیگر مانند SSR و یا تراشه ژنومی استفاده می شود.
در مرحله نهایی قطعات توالی یابی شده با ژنوم رفرنس مقایسه شده و سپس با مطالعات بیوانفورماتیکی
SNP های عاملی و پلی مورفیک شناسایی می شود. در این مرحله حدود ۲۰ میلیون SNP ممکن است تشخیص داده شود که از این تعداد ممکن است ۱۰ درصد از این ماکرها، SNP های پلی مورفیسم بالاتر داشته باشند که اختصاصا مربوط به این نژاد خواهند بود که در تراشه اختصاصی و درنسخه های بعدی تراشه های ژنومی تجاری موجود اضافه خواهند شد.
بعد از تشخیصSNP های عاملی باید اطلاعات فنوتیپی را با این SNP ها آنالیز نمود که به این مرحله مطالعات پیوستگی پویش ژنومی(GWAS) گویند و تاثیرSNP ها را بر صفات عملکردی برآورد می کنند که از نتایج این بخش می توان انتخاب ژنومیکی برای اسبهای جوان که دارای SNP های مفید هستند، استفاده کرد.